Поиск диагностически значимых маркеров микросателлитной нестабильности при агрессивных лимфомах. Результаты исследования.

Научное исследование, направленное на поиск патогенетических путей возникновения, развития и прогрессирования опухоли, обусловливает потенциальную возможность разработки оригинальных терапевтических подходов при агрессивных лимфомах.

Мангасарова Яна Константиновна (НМИЦ гематологии Минздрава России), г. Москва

Выделение особенностей генетического ландшафта опухоли, которые обладали бы прогностическим значением в дебюте заболевания, является актуальной задачей. Проявления геномной нестабильности крайне вариативны и охватывают нарушения от генома в целом, до изменения отдельных нуклеотидов. Поддержание стабильности генома, осуществляется многокомпонентным комплексом репарации, отвечающим за детекцию и ликвидацию участков измененной последовательности ДНК.

Возможность приобретения и сохранения в последующих клеточных поколениях мутаций реализуется при функциональном дефиците этой сложной системы. Система репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR – mismatch repair) представляет собой одно из ее ключевых звеньев. Проявление дефицита системы репарации ДНК — нестабильность мононуклеотидных микросателлитных повторов высокой степени (MSI-H) – является определяющим фактором в выборе специфической терапии ингибиторами иммунных контрольных точек (ИКТ) для ряда солидных опухолей, наибольшее число исследований и клинических протоколов было проведено на примере колоректального рака.

Нестабильность тетрануклеотидных микросателлитов EMAST также контролируется комплексом репарации ДНК, но как прогностический признак, этот феномен исследован мало, а для лимфом практически вообще не изучен. Потеря гетерозиготности (LOH) является другим интегральным показателем геномной нестабильности и имеет ассоциацию с хромосомными регионами, что может указывать на более частные пути патогенеза и вовлечение потенциальных генов — супрессоров опухоли или онкогенов. Значение MSI, EMAST и LOH при первичной медиастинальной лимфоме, характеризующейся агрессивным течением, не исследовано.

При поддержке гранта РакФонда (2020-02) впервые в мире проанализирована частота MSI, LOH и EMAST в опухолевых клетках пациентов с ПМВКЛ^* и ДВККЛ^** в дебюте заболевания. Для пациентов с ПМВКЛ оценена ассоциация с данными иммуногистохимического исследования и корреляция с ответом на терапию. Продемонстрировано, что потеря гетерозиготности выявлена у 37 из 72 пациентов (51,4%). EMAST обнаружили у 40 пациентов (55,5%); у 24 из них в комбинации с LOH.

Для всех EMAST — положительных пациентов количество вовлеченных локусов было не более 4 из 19 (EMAST-low, менее трети панели микросателлитных маркеров). Достоверного статистического влияния статуса LOH/EMAST на выживаемость пациентов не было отмечено. Возможно, данный факт связан с небольшим количеством неудач в лечении в рамках реализуемого в ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ высокоэффективного ПЭТ-адаптированного протокола лечения. В контрольной группе (46 пациентов с ДВККЛ) потеря гетерозиготности наблюдалась у 20 пациентов (43,5%), наиболее часто встречались LOH7q и loss Y. EMAST обнаружен у 11 пациентов (23,9%), наиболее часто наблюдали EMAST 4q. Феномен MSI-H не был обнаружен ни у пациентов с ПМВКЛ, ни у пациентов с ДВККЛ.

В результате проведённой работы мы сделали вывод, что необходим пересмотр диагностической панели микросателлитных локусов и поиск индивидуальных, более характерных для ПМВКЛ, маркеров геномной нестабильности. И, как логическое продолжение, нами были созданы тест-системы для оценки аллельного дисбаланса в «горячих точках», вовлеченных в патогенез ПМВКЛ. Методом STR-ПЦР был исследован аллельный дисбаланс (АД) в области гена CIITA (локусы 16p13.13 ((ca)n и (gt)m) у 61 пациента с ПМВКЛ, из них гены PDL1/PDL2 (локусы 9p24.1 ((gt)n и (ttat)m) проанализировали у 49 пациентов.

Стабильный STR-профиль локусов PDL1/PDL2 выявлен у 24 пациентов (из 49) (49%), АД по обоим маркерам отмечен у 14 человек (29%), у 11 пациентов (22%) АД отмечался по одному маркеру, при этом второй маркер был гомозиготным (а значит, не являлся информативным для оценки потери гетерозиготности) в контрольной ДНК. В анализ STR-маркеров в гене CIITA был включен 61 пациент. Стабильный STR-профиль выявлен у 41 пациента (67%), АД по обоим маркерам отмечен у 12 человек (20%), у 8 пациентов (13%) АД отмечался по одному маркеру, второй маркер был гомозиготным в контроле. АД 9p24.1 и 16p13.13 являются независимыми событиями (p<0,05). Мы успели протестировать 35 пациентов из контрольной группы ДВККЛ на потерю гетерозиготности в локусе 9p24.1. 10 из них были гомозиготны в контроле по обоим маркерам, исследуемым в тест-системе. Из 25 пациентов с гетерозиготным герминальным вариантом, выявленным хотя бы по одному маркеру, аллельный дисбаланс в опухолевой ДНК наблюдали у троих (12%), и у одного пациента был выявлен EMAST (4%). Таким образом, мы нашли STR-локус, в котором при ПМВКЛ значительно чаще фиксируются аберрации, связанные с изменением числа копий ДНК, чем при другом виде агрессивных лимфом.

В рамках реализации гранта получены первые в мире данные о признаках нестабильности генома при ПМВКЛ и продемонстрировано, что оценка аллельного дисбаланса в патогенетически значимых локусах позволяет повысить частоту выявления данного феномена. При исследовании АД в STR-локусах 16p13.13 и 9p24.1, важных для патогенеза ПМВКЛ, выявлена высокая частота аберраций микросателлитных повторов, особенно в локусе 9р24.1, значимо превышающая число аберраций, выявленных стандартными STR-панелями, и отличающая эту группу пациентов от пациентов с ДВККЛ. Исследование связи аберраций STR в регионе 9p24.1 с ответом на терапию ИКТ представляется перспективным направлением.

Продолжением исследования послужили разработка индивидуальных панелей для оценки микросателлитной нестабильности и регистрация нового рандомизированного многоцентрового исследования эффективности и безопасности комбинации ИКТ с иммунохимиотерапией у пациентов ПМВКЛ.

Выражаю благодарность всем сотрудникам ФГБУ «НМИЦ гематологии» лаборатории молекулярной гематологии (зав.лаб, д.б.н. Судариков А.Б.), патологоанатомической лаборатории (зав.лаб, д.б.н. Ковригина А.М.), лаборатории генной
инженерии (зав.отд. Сурин А.В.), отделению химиотерапии лимфом с блоком ТКМ и ГСК с ДС и генеральному директору д.м.н. Паровичниковой Е.Н. Спасибо тем, кто вдохновил и позволил реализовать данный проект: Рисинской Н.В., Никулиной Е.Е., Абдурашидовой Р.Р., Щуплецовой И.А., Ковригиной А.М. и Сударикову А.Б.

^{* Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома}

^{**Диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома}